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LB膜分析儀-α-短螺旋抗菌肽對癌細胞選擇性及其抗癌作用的分子機制:摘要、介紹、材料和方法

來源:上海謂載 瀏覽 25 次 發布時間:2022-02-28

摘要


開發對宿主細胞具有良好生物相容性但對癌細胞具有高效力的功能性生物材料和藥物是一項具有挑戰性的工作。通過利用天然抗菌肽和a-螺旋蛋白的優勢特性,我們設計了一類新的短a-螺旋肽G(IIKK)nI-NH2(n細胞)。我們表明,含有?n1e4的肽具有不同的效力和對癌癥?3和4的高選擇性,能夠有效殺死癌細胞,同時在其工作濃度下對宿主細胞保持良性,通過類似于殺菌效果的機械過程。細胞的高選擇性可能源于它們優先與帶有負電荷和高流動性的細胞外膜結合。除了快速透膜能力外,這些肽還可以通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導癌細胞的程序性細胞死亡,而不會誘導非特異性免疫原性反應。重要的是,這些肽還可以在小鼠異種移植模型中抑制腫瘤生長,而不會引起副作用。雖然這項研究揭示了這些肽作為強效藥物和其他醫療保健應用的臨床潛力,但它也指出了基礎材料研究在高選擇性肽功能材料未來發展中的重要性。

1.導言


尋找高效低毒副作用的新藥已成為功能性生物材料研究的重要方向。盡管治療方法取得了巨大進步,但癌癥仍然是全世界致死的主要原因?;熓悄壳爸委煹闹饕呗灾?,尤其是對于那些處于晚期或轉移階段的患者[1]。然而,對正常細胞和組織的嚴重副作用以及癌細胞容易獲得多藥耐藥性往往與常規化療藥物密切相關。因此,開發對正常宿主細胞具有低毒性的新型抗癌藥物和不利于耐藥性的獨特作用模式代表了開發更有效抗癌材料的新方向。這一領域的進展可能會在醫療保健和治療策略方面開辟新的應用領域。


一段時間以來,天然抗菌肽(AMPs)及其合成類似物一直被視為新抗生素的潛在來源。AMP對廣泛的微生物表現出不同的抗菌活性,有趣的是,其中一些還表現出對癌細胞的毒性,但對正常哺乳動物細胞的生物相容性程度不同[2e4]。此外,由于這些AMP主要通過非受體介導的途徑作用于靶細胞膜,與傳統化療藥物相比,癌細胞更難產生耐藥性[3,4]。由于這些理想的特性,研究和開發具有癌細胞毒性的AMPs可能會在開發更好的抗癌藥物方面取得進一步進展。短的線性陽離子AMP在與其靶相互作用時折疊成兩親構象,代表了抗菌肽的一種特別成功的結構安排[5e7]。為了提高其在治療應用中的前景,并研究結構活性關系,已經設計和合成了許多類似物,以模擬天然AMPs的特征,并有不同的成功報道。主要障礙在于調整針對宿主細胞的毒性的效力。


為了模擬AMPs和含有簡單a-螺旋重復序列的蛋白質的結構功能特征,我們最近開發了一類含有簡單序列重復序列的短陽離子肽,G(IIKK)nI-NH2(n?1e4)[8]。IIKK模塊在與兩親膜接觸時促進a-螺旋結構,并且隨著n的增加,其結構傾向性提高。C端的額外I殘基穩定了分子,進一步促進了二級結構的反應性;COO的C端電荷阻斷在觸發初始響應和隨后的選擇性調節以響應不同的外膜表面時非常敏感。因此,它們對抗天然AMP和療法的性能需要實驗驗證。


我們發現這些短合成肽具有很強的抗癌活性。為了探索其實際相關性,我們利用成人皮膚真皮成纖維細胞(HDFa)進行了選擇性評估,采用了我們之前使用NIH 3T3細胞系作為宿主細胞開發的培養實驗方法[8]。雖然我們在這里的主要目的是研究與所設計的肽的細胞選擇性和抗癌活性相關的機械過程,但本研究也檢查了它們對人類淋巴細胞的免疫原性反應及其對裸鼠異種移植瘤的治療效果。


2.材料和方法


2.1.化學試劑與細胞培養


Rink amide MBHA樹脂、受保護氨基酸以及用于肽合成的其他試劑和溶劑從德國勞埃德生化有限公司(中國上海)購買。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化銨(MTT)、鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(鈣黃綠素AM)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和異硫氰酸熒光素(FITC)-甲環素從西格瑪(密蘇里州圣路易斯)獲得。5,50,6,60-四氯-1,10,3,30-四乙基苯并咪唑碳菁碘(JC-1)、抗Cyt c單抗體(小鼠,IgG2b)和FITC標記的山羊抗小鼠二級抗體購自Beyotime Biotechnology(江蘇,中國)。所有實驗中使用的水都是經過密理博密理Q去離子處理的(18.2μcm)。


HeLa(人宮頸癌細胞)和HL60(人早幼粒細胞白血病細胞)由上海細胞生物學研究所細胞庫提供。成人真皮成纖維細胞(HDFa)是從體外獲得的。癌細胞系在含有10%熱滅活FBS(胎牛血清)的IMDM(Iscove改良的Dulbecco培養基)中培養,而原代HDFa細胞在補充了LSGS(低血清生長補充劑)和抗生素(阿莫西林和青霉素)的M106培養基中培養,溫度為37℃,二氧化碳濃度為5%。


用標準的菲科爾法從全血細胞中分離人淋巴細胞。簡而言之,用10毫升PBS稀釋從健康志愿者獲得的10毫升血液,然后將稀釋后的血液小心地添加到1.077克/毫升的Ficoll溶液中,Ficoll與血液的比例為2:1。在2000 rpm下離心15分鐘后,在不接觸Ficoll溶液的情況下收集含有淋巴細胞的環。淋巴細胞用PBS洗滌至少三次,然后懸浮在PBS中使用。


通過1000 g離心從血液中分離人類紅細胞(h-RBC),用PBS洗滌三次,然后在PBS中懸浮至8%(v/v)以供使用。


2.2.肽合成


G(IIKK)nI-NH2(n?1e4)肽是使用商用CEM Liberty肽合成器,使用標準的Fmoc固相肽合成程序制備的。在Rink酰胺MBHA樹脂上從C端到N端進行合成,從而產生C端酰胺化肽。更多細節,包括樹脂的脫保護、偶聯和切割,已在前面描述[9e11]。請注意,N端FITC標記的G(IIKK)3I-NH2也是通過固相化學合成的,我們之前的工作[8]中報告了詳細的步驟。在旋轉蒸發后,通過冷乙醚沉淀至少八次純化粗肽產品,然后冷凍干燥2天。HPLC和MS分析表明,最終產物純度高(>95%)。


2.3.細胞毒性試驗


MTT法檢測這些肽的體外細胞毒性。簡單地說,癌癥或HDFa細胞(w1105細胞/mL,100 mL)在96孔板中預培養。培養24小時后,用100毫升2倍稀釋肽溶液(0e50 mM)處理細胞并繼續培養24小時。然后向每個孔中加入20毫升MTT溶液(PBS中,5 mg/mL)并培養4小時。隨后,直接去除HeLa或HDFa細胞的上清液,而對于HL60細胞,以1000 rpm的轉速離心培養物5分鐘,然后去除上清液。向每個孔中加入150 mL二甲基亞砜(DMSO),將孔的上清液轉移到新的96孔板中,并使用微孔板讀取器(M2 e,分子裝置)記錄570 nm處的吸光度。不含肽的孔用于對照,不含細胞的孔用于分光光度計的空白。實驗至少獨立進行了三次。


通過檢測不同肽存在時h-RBC的血紅蛋白釋放來測定肽的溶血活性。將來自健康志愿者的h-RBC洗滌三次,并以8%(v/v)懸浮在PBS中。將100毫升2折疊肽溶液添加到96孔無菌板中的孔中。然后將等分(100 mL)的h-RBC懸浮液添加到孔中,以獲得200 mL的總體積。在37℃下將培養皿培養1 h,然后在1000 g下離心5 min。將等分(100 mL)的上清液轉移到新的96孔培養皿中,通過測量540nm處的吸光度來監測血紅蛋白的釋放。以PBS和0.1%Triton X-100中的血紅蛋白釋放值作為陰性和陽性對照。


2.4.G(IIKK)3I-NH2的細胞選擇性


為了在體外評估G(IIKK)3I-NH2的選擇性相互作用,將FITC-G(IIKK)3I-NH2加入含有原代細胞(HDFa)和腫瘤細胞(HL60)的共培養系統(8孔板),最終肽濃度為20 mM。在37C和5%CO2孵育1小時并采用適當的分離程序(詳細程序見參考文獻8)后,用徠卡DMI3000熒光顯微鏡觀察兩種細胞中的肽分布。


2.5.肽對不同脂質單分子膜的滲透


在多孔板Kibron微槽X(Kibron Inc.,芬蘭赫爾辛基)中跟蹤肽滲透到不同的脂質單層。表面壓力(p)通過使用連接到Delta-Pi微天平(芬蘭赫爾辛基Kibron公司)的Wilhelmy板進行監測。氯仿中的脂質溶液在空氣緩沖界面(10 mM TriseHCl,154 mM NaCl,pH 7.4)擴散。在不同初始表面壓力(pi,范圍為10至40 mN/m)下進行溶劑蒸發和單層平衡后,將肽溶液注入單層下方,亞相中的最終肽濃度為3 mM。然后監測表面壓力隨時間的變化,并在30分鐘內獲得平衡表面壓力(pt)。為了比較G(IIKK)3I-NH2穿透飽和(DPPC)和不飽和(POPC)磷脂單分子膜的能力,初始表面壓力保持在30 mN/m左右。所有測量均在201C下進行。


2.6.G(IIKK)3I-NH2在HeLa細胞中的定位


將HeLa細胞(w1105細胞/mL)預先接種在6孔板中24小時,然后將FITC-G(IIKK)3I-NH2以10 mM的最終濃度添加到孔中。在37℃下培養1小時或24小時后,用PBS清洗細胞至少三次。用激光共聚焦顯微鏡(Nikon AI si)觀察FITC-G(IIKK)3I-NH2在HeLa細胞中的分布。


2.7.膜完整性


HeLa細胞(w1105個細胞/mL)在37C下預先接種在無菌96孔板上24小時。細胞用PBS清洗,并在37C下用鈣黃綠素AM(1 mM)染色30分鐘。用PBS清洗三次后,向每個孔中加入100 mL PBS,并通過微孔板自動讀數器記錄熒光(在490 nm處激發,在515 nm處發射),所得值作為對照。隨后,在37C下用最終肽濃度為10 mM的G(IIKK)3I-NH2處理這些細胞不同時間(10 min 6 h)。在肽處理后,用PBS清洗細胞三次,并再次記錄細胞在100 mL PBS存在下的熒光。用PBS和1%Triton X-100處理的細胞分別作為陰性和陽性對照。


為了檢查細胞形態變化,將HeLa細胞(w1105個細胞/mL)在無菌6孔板底部的蓋玻片上預接種37C 24小時。預接種的細胞在37C下用濃度為10 mM的G(IIKK)3I-NH2處理24小時,然后用PBS洗滌細胞兩次,用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS廣泛洗滌固定的細胞,并用不同濃度的乙醇脫水。在臨界點干燥和用濺射鍍金機鍍金后,使用JSM-840掃描電子顯微鏡在15 kV下觀察樣品。


2.8.F-肌動蛋白、細胞核、線粒體膜電位和細胞色素c的熒光染色


對于熒光染色,將HeLa細胞(w1105個細胞/mL)預先接種在6孔板中24小時,然后向孔中添加最終濃度為10 mM的G(IIKK)3I-NH2。在37℃下培養24小時后,用PBS清洗細胞,并用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS清洗固定的細胞,并在37℃下用FITC phalloidin(5 mg/mL)對其進行F-肌動蛋白染色或用DAPI(6 mg/mL)對其進行核染色30分鐘。用PBS清洗后去除未結合的染料,熒光顯微鏡下觀察染色細胞。


為了跟蹤線粒體電位的變化,肽處理的HeLa細胞(本例中不使用4%多聚甲醛固定)在37C下用JC-1(10 mg/mL)染色20分鐘。然后用PBS洗滌染色的細胞,并用熒光顯微鏡觀察。


用抗細胞色素c單抗(mAb,小鼠IgG2b)對細胞色素c(Cyt-c)進行免疫熒光染色,觀察細胞色素c(Cyt-c)在HeLa細胞中的分布。簡單地說,在用4%多聚甲醛固定后,用0.1%Triton X-100使肽處理的HeLa細胞通透性5分鐘,然后用封閉緩沖液(PBS中10%(v/v)胎牛血清)封閉30分鐘。在用PBS洗滌后,這些細胞在37℃下與抗Cyt c單克隆抗體(1:50)孵育1小時,并用PBS洗滌5分鐘以去除未結合的抗體,然后與FITC標記的山羊抗小鼠二級抗體(1:100)孵育1小時。在用PBS廣泛洗滌以去除未結合的二級抗體后,用激光共聚焦顯微鏡觀察這些細胞。在上述所有熒光染色實驗中,未經肽處理的細胞被用作對照。


2.9.DNA片段的凝膠電泳


將HeLa細胞(w1106個細胞/mL)預先接種在無菌6孔培養皿中24小時。在37C下與10 mM G(IIKK)3I-NH2培養不同時間間隔(48、24、12和6小時)后,收集HeLa細胞,并在37℃下用裂解緩沖液(0.8%十二烷基硫酸鈉、100 mM三氯化鈉、20 mM EDTA、0.15 mg/mL核糖核酸酶a、pH8.0)裂解2小時。裂解后,裂解物在50℃下與20 mL蛋白酶K(20 mg/mL)再孵育24小時,然后在含有0.5 mg/mL溴化乙錠(EB)的2%瓊脂糖凝膠上進行電泳。


2.10.RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈反應和實時聚合酶鏈反應)


為了確定HeLa細胞凋亡和淋巴細胞免疫效應的相關基因轉錄活性,進行了RT-PCR檢測。簡單地說,HeLa細胞與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育不同的時間間隔(1、3、6和12 h),淋巴細胞與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育1 h。按照制造商的說明(英國因維特羅根)用Trizol提取細胞總RNA??俁NA(1mg)通過隨機引物(PrimeScript逆轉錄酶,日本Takara)進行cDNA合成。根據制造商的協議,使用power SYBR green PCR Master Mix kit(美國應用生物系統公司)和7500實時PCR系統(美國應用生物系統公司)進行實時PCR,并通過2 DDCt方法的相對定量分析數據。相關基因的轉錄水平被標準化為管家基因b-肌動蛋白的值。使用以下引物:b-肌動蛋白義:50-ATGCAGGGTACATGTGGT-30,反義:50-TCGTGCGTGACATTAAGAG-30;aspase-8義:50-ATGGACTTCAGCA-GAAATCTT-30,反義:50-CATGTCATCCAGTTGC-30;fas-sense:50-attatccaaagtgtta-30,反義:50-tcacaatcatctt-CTG-30;fas-L義:50-ATGCAGCCTTCAATT AC-30,反義:50-CAATCTACAGCAAGGCAC-30;IL2義:50-CaCaAttaacctCactCC TGCCAC-30,反義:50-cGTTGATTCTGATTAGCTGTAGTCATCTG-30;IL8順義:50-CGGAAGAACCATCCATCGTGTGG-30,反義:50-AGAATCAGAGAAG GCTGCCAAG-30。


2.11.對人宮頸癌異種移植瘤生長的抑制作用


肽,包括G(IIKK)3I-NH2和G(IIKK)4I-NH2,分別表示為3#和4#,在無菌PBS中溶解,濃度分別為0.15 mg/mL和0.5 mg/mL。當腫瘤達到平均體積100 mm3時,將PBS中的100 mL人宮頸癌HeLa細胞(2106個細胞/mL)皮下接種到5至6周齡裸鼠(BALB/c-null)的腋窩中(接種后5天),將小鼠隨機分為五組(每組5只)。通過腹腔注射將200e250 mL制備好的肽溶液注射到小鼠體內,最終劑量為1.5 mg/kg或5 mg/kg,并將200e250 mL PBS注射作為陰性對照。請注意,我們將這一天定義為第0天。注射每隔一天進行九次。在治療期間,每兩天測量一次小鼠的腫瘤大小和體重。在第18天,處死小鼠,移除腫瘤,拍照并稱重。